放線菌(Actinomycetales)是一類介于細菌與 絲狀真菌之間而又接近于細菌的一類絲狀原核生 物,因氣生菌絲呈放射狀而得名,放線菌目可分為 10個亞類,其代表菌屬主要有鏈霉菌屬(Strepto- mycetes)?小單孢菌屬(Micromonospora)?諾卡氏 菌屬(Nocardia)?馬 杜 拉 放 線 菌 屬 (Actinomadu- ra)?游動放線菌屬(Actinoplanes),其中以鏈霉菌屬為主。放線菌能產(chǎn)生豐富的、活性多樣的次 級代謝產(chǎn)物，人類的生產(chǎn)、生活有著極為密切的關(guān) 系，其天然代謝產(chǎn)物一直是現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜 牧業(yè)中藥物先導(dǎo)化合物的一個重要來源，如阿維 菌素、鏈霉素、寧南霉素、多抗霉素等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中有很重要的地位，同時應(yīng)用代謝產(chǎn)物防治植物 病害，可減少農(nóng)藥的用量，維系生態(tài)平衡，確保農(nóng) 業(yè)可持續(xù)發(fā)展。 生防 菌 弗 氏 鏈 霉 菌 Ｋ－７為 金 正 大 微 生 物 實 驗室前期從臨沭黃瓜大棚中篩選得到，其發(fā)酵液 上清對黃瓜枯萎病菌、香蕉枯萎病菌等多種病原 菌都有很強的抑制作用，為進一步研究其抑菌物 質(zhì)的成分及能否在功能性肥料中添加使用，本研究通過對 Ｋ－７發(fā)酵液上清經(jīng)過高溫和高鹽分處 理，看發(fā)酵液上清中抑菌物質(zhì)對溫度和鹽分的耐 受性，為后期純化、成分分析及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用 提供依據(jù)。

生防菌弗氏鏈霉菌 Ｋ－７為金正 大微生物實驗室保存，前期研究表明在其發(fā)酵液 上清中含有抑菌物質(zhì)。

黃 瓜 立 枯 病 菌（ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）、香 蕉 枯 萎 病 菌 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ），所用供試病原菌菌 株 均由本實驗室保存。

ＰＤＡ 液 體 培 養(yǎng) 基：馬 鈴 薯２００ ｇ，葡 萄 糖２０ｇ，蒸 餾 水１０００ｍＬ。ＰＤＡ 固 體 培 養(yǎng)基：馬鈴薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，瓊脂１５ｇ，蒸餾 水１０００ｍＬ。

亞磷酸二氫鉀，分析純，由金正大 生態(tài)集團股份有限公司提供；實驗所用其它化學(xué) 試劑均為分析純或按國家標準（ＧＢ）規(guī)定要求。

分析天平(德國賽多利斯)、 智微立式滅菌鍋、無菌操作工作臺、生化培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、 知楚搖床、打孔器、玻璃器皿等。

取 ４ ℃冰 箱 中 ＰＤＡ 斜 面 保 存 的 Ｋ－７ 菌 株 在 固 體 ＰＤＡ 平板上劃線 活 化，放 于２８ ℃生 化 培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng)４ｄ。然后在超凈工作臺中用直徑９ｍｍ 的打 孔器打菌片，挑 取４片 放 入 裝 有２００ｍＬ 培 養(yǎng) 基 的１Ｌ三角瓶中，放入２８ ℃恒溫搖床培養(yǎng)６０ｈ。 培養(yǎng)完成后８０００ｒ·ｍｉｎ－１，離心２０ｍｉｎ，上清即為 弗氏鏈霉菌 Ｋ－７發(fā)酵液上清。

含 藥平板的制備：配制 ＰＤＡ 培養(yǎng)基，定量分裝于三 角瓶內(nèi)滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至５０℃左右時加入相 應(yīng)的發(fā)酵液上清，制成含有不同濃度抑菌物質(zhì)的 培養(yǎng)基，搖勻后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)冷凝備用。 發(fā)酵液抑菌效果測定：將各指示菌株 接 種 至ＰＤＡ 平板上，２８ ℃培養(yǎng)４８ｈ，用直徑為９ｍｍ 打 孔器打取菌落邊緣菌塊作為接種物。將菌塊隨機 轉(zhuǎn)接到含有不同濃度抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)皿中央，以 不加發(fā)酵液上清的培養(yǎng)基作空白對照，每一處理 重復(fù) ３ 次，置于２８ ℃下培養(yǎng)２ｄ ，利用十字交叉 法測量菌落直徑按照下面求出發(fā)酵液對供試菌的 抑制率。 抑制率（％）＝（對照菌落直徑－處理菌落直 徑）／對照菌落直徑×１００

取滅菌 的１０ｍＬ離心管數(shù)只，每只裝入５ｍＬ 弗氏鏈霉 菌 Ｋ－７發(fā)酵液上清，分別放到２５，６０，８０ ℃（分別 標記為 Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）恒 溫 烘 箱，處 理 時 間 為４ｈ。 處理完成后按１．２．２的活性測定方法測定高溫處 理后的上清 液 中 抑 菌 物 質(zhì) 的 活 性，純 ＰＤＡ 培 養(yǎng) 基（ＣＫ）作為對照。

取發(fā)酵液上清加入一定量的亞磷酸二氫鉀配成 母液，充分溶解后室溫放置４８ｈ后按１．２．２的方 法測定上 清 液 抑 菌 成 分 對 黃 瓜 立 枯 病 菌 抑 菌 活 性，等濃度的亞磷酸二氫鉀溶液和未加鹽處理的 上清液作為對照。試驗處理分別為 Ｔ１：１００ｇ·Ｌ－１ 的亞磷酸二氫鉀；Ｔ２：１００ｇ·Ｌ－１的亞磷酸 二 氫 鉀 和發(fā)酵液上清復(fù)配；Ｔ３：發(fā)酵液上清，配置帶毒平 板時按１０、２０、５０和１００倍稀釋加入。

采 用 Ｅｘｃｅｌ２０１３ 和 ＳＰＳＳ １８．０進 行 數(shù) 據(jù) 處 理，采 用 Ｄｕｎｃａｎ′ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅｔｅｓｔ中 的 方 差 分 析 （ＡＮＯＶＡ）方 法 進 行 分析。

由表１可知，不同溫度處理的弗氏鏈霉菌 Ｋ－ ７發(fā)酵液上清對黃瓜立枯病菌、香 蕉 枯 萎 病 菌 均 有不同程度的抑制作用，比較 Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３三個溫 度處理后對立枯病菌和枯萎病菌的抑制率均無顯 著差異，抑制率沒有明顯變化，說明發(fā)酵液上清經(jīng) ６０和８０ ℃處理后，其中的抑菌物質(zhì)活性沒有明 顯變化，說明其抑菌物質(zhì)對８０ ℃高溫較為穩(wěn)定。

２．２ 亞磷酸二氫鉀對放線菌代謝產(chǎn)物的影響

由表２可知，不同處理的弗氏鏈霉菌 Ｋ－７發(fā) 酵液上清對黃瓜立枯病菌均有不同程度的抑制作 用，比較同一 稀 釋 梯 度 抑 制 率，可 以 看 出 Ｋ－７發(fā) 酵液上清和高濃度亞磷酸二氫鉀復(fù)配（Ｔ２）后，對 絲核菌的抑制效果顯著優(yōu)于單獨上清液（Ｔ３），二 者顯著優(yōu)于單獨的亞磷酸二氫鉀（Ｔ１）處理，說明 發(fā)酵液上清中的抑菌物質(zhì)對高濃度亞磷酸二氫鉀 較為穩(wěn)定。

３ 結(jié)論與討論

通過 對 生 防 菌 弗 氏 鏈 霉 菌 Ｋ－７所 產(chǎn) 抑 菌 物 質(zhì)的穩(wěn) 定 性 研 究 發(fā) 現(xiàn)，Ｋ－７ 所 產(chǎn) 抑 菌 物 質(zhì) 能 在 ８０ ℃下放置４ｈ其抑菌活性沒有顯著下降，說明 對溫度較為穩(wěn)定，因為在后期提純過程會經(jīng)過高 溫滅活、噴霧干燥等過程，Ｋ－７所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對高 溫較為穩(wěn)定，有助于后期進行提純并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)進行進一步的研究。 弗氏 鏈 霉 菌 Ｋ－７發(fā) 酵 液 上 清 和 亞 磷 酸 二 氫 鉀復(fù)配成１００ｇ·Ｌ－１的鹽溶液放置４８ｈ后，復(fù)配液 對黃瓜立枯病菌的抑制率優(yōu)于單獨的 Ｋ－７發(fā) 酵 液上清，優(yōu)于單獨的亞磷酸二氫鉀溶液，說明 Ｋ－７ 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對高濃度亞磷酸二氫鉀較為穩(wěn)定。 有研究認為，亞磷酸鹽能干擾和抑制病菌菌絲生 長及產(chǎn)孢，直接保護寄主，同時亞磷酸鹽施用后被 葉片、根部吸收，運送至植株體內(nèi)，等植物病菌入 侵時，刺激植株產(chǎn)生植物防御素。Ｋ－７所產(chǎn)抑 菌物質(zhì)對高濃度亞磷酸二氫鉀較為穩(wěn)定，同時能 加強亞磷酸鹽對立枯病菌、枯萎病菌等植物病害 的抑制作用，可以復(fù)配成農(nóng)藥或者肥料，在農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)中應(yīng)用。 植物病害是嚴重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的自然生物災(zāi) 害之一，植物的健康和人的生活和健康息息相關(guān)。 常年化學(xué)農(nóng)藥的防治，導(dǎo)致防治效果下降，同時污 染了環(huán)境，也影響著人們的身體健康；放線菌種類 繁多，代謝功能各異，能產(chǎn)生大量的，種類繁多的 抗生素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上起重要作用，如用阿維菌素 防 治 根 結(jié) 線 蟲，用井岡霉素防治水 稻紋枯 病，用寧南霉素防治煙草花葉病毒病都取得了 極好的效果，同 時 又 綠 色 環(huán) 保，不 會 污 染 環(huán) 境 和影響人類健康。